Original: https://people.csail.mit.edu/seneff/does_glyphosate_substitute.html

autor: Stephanie Seneff

[email protected]
18. august 2019

Hiljuti avaldasid dokumendi Antoniou jt. rasvase pealkirjaga “Glüfosaat ei asenda glütsiini aktiivselt jagavate imetajarakkude valkudes”. [1]. Selles dokumendis paluti inimese rinnavähirakkudel paljastada glüfosaat kuue päeva jooksul ja seejärel kasutada keerukat tehnikat, mida nimetatakse Tandem Mass Tag (TMT) märgistamiseks, et tuvastada väidetavalt anomaalselt raskeid glütsiini molekule sisaldavaid lühikesi peptiide. Nii töödeldud kui ka töötlemata rakkude valgud viidi läbi standardprotokolliga, mis hõlmas massispektromeetriat, osalist proteolüüsi ja täiendavat analüüsi, nagu artiklis üksikasjalikult kirjeldatud.

Rakke hoiti rikkalikus toitevormis, mida nimetati Dulbecco modifitseeritud kotka keskmiseks. See ravimvorm on algse Basal Medium Eagle’i modifikatsioon, mis on neljakordselt rikastatud aminohapete ja vitamiinidega. Samuti on sellel kõrge glükoosi kontsentratsioon 4500 mg/l. Pole mingit garantiid, et see pole glüfosaadiga saastunud. Lisaks oli rakke varem kasvatamata kultuuris kasvatatud ja tõenäoliselt oli neile kogunenud märkimisväärne arv valesti kokku pandud glüfosaadiga saastunud valke, mida oli raske puhastada. Tõenäoliselt alustasid nad oma elu kultuuris juba glüfosaadiga saastunud valkudega, puutudes elu jooksul kokku glüfosaadiga inimesel, kes neid rakke algselt peitis piimanäärmekasvajas.

Autorid testisid proove kahe erineva translatsioonijärgse modifikatsiooni (PTM) suhtes: glüoksülaadiga modifitseeritud tsüsteiin ja glüfosaadi asendus glütsiiniga. Need hõlmasid glükoksülaadi modifikatsiooni, kuna nad oletasid, et glüfosaat võib laguneda glüoksülaadiks, mis on võimeline seonduma tsüsteiinijääkidega. Nimelt ei tuvastanud nad kontrollrakkudes ega töödeldud rakkudes ühtegi glüoksülaadiga modifitseeritud tsüsteiini.

Seevastu autorid leidsid töödeldud proovides olulise signaali glüfosaadi esinemise kohta mitmes lühikeses peptiidis. Kuid sama tugeva signaali leidsid nad ka töötlemata proovidest. Nad kirjutasid: “Selles eksperimendis ei eeldata, et glüfosaadiga töötlemise korral ei oleks kumbagi huvipakkuvat arvatavat PTM-i (posttranslatsioonilised modifikatsioonid) ilma glüfosaadiga. Seega oli TMT märgistuse abil võimalik tuvastada ja filtreerida potentsiaalsed valed avastused. “Ja siis:” Andmed näitavad lõplikult, et kõik kandidaat-asendatud peptiidid on valed avastused.”

Sama usutav argument on aga see, et “töötlemata” rakkudes on ka glüfosaadiga asendatud valgud. Potentsiaalselt on enamik, kui mitte kõik kandidaat-asendatud peptiidid tõelised avastused. Kuna nii töödeldud kui ka kontrollrakud olid varem glüfosaadiga kokku puutunud, on usutav, et neil mõlemal oli glüfosaadiga saastunud valke kogunenud peaaegu võrdsetes kogustes. Anthony Samsel ja mina arutasime oma esimeses dokumendis glüfosaadi asendamisest glütsiiniga tõendite kohta, et N-asendatud glütsiinid võivad moodustada peptoide, mida on väga raske lagundada, ja fosfonaatidel on tõestatud võime proteolüüsi pärssida [2].

Ideed, et glüfosaadi ekspositsioon põhjustab proteolüüsi suhtes resistentsete valkude kuhjumist, toetab 2013. aastal hernetaimede kohta avaldatud uuring [3]. Autorid täheldasid ubikvitineeritud valkude kuhjumist koos proteolüüsi ensüümide ülesreguleerimisega, mis on üllatav ja ebatavaline. Nad kirjutasid:

“Ubikvitineeritud valkude kuhjumist koos oletatava proteasoomi aktiivsuse suurenemisega täheldati ABPP [Tegevuspõhine valgu profileerimine] kaudu, mis osutab proteasoomi rollile herbitsiididega töötlemisel. Ubikvitineeritud valkude kuhjumist on tavaliselt kirjeldatud koos samaaegse Sellegipoolest näitasid meie tulemused nii proteasoomi substraadi taseme kui ka aktiivsuse suurenemist. Seega võib herbitsiididest põhjustatud stress proteoomil põhjustada ubikvitineeritud valkude akumuleerumist hoolimata proteasoomi aktiivsuse suurenemisest või substraadi suurenenud kättesaadavusest esile kutsuda proteasoomi.”

Tõenäoline seletus on see, et valkudesse kinnitatud glüfosaat rikub proteolüütiliste ensüümide võimet seda lagundada. Tegelikult kirjeldasime dokumendis, milles glüfosaat seostati amüotroofse lateraalskleroosiga (ALS), kuidas glüfosaat võib häirida ubikvitineerimisprotsessi ennast, mis tähistab valke proteasoomi poolt kustutamiseks [4]. Me kirjutasime:

“Kõige intrigeerivam on asjaolu, et ubikvitiin ise sõltub kriitiliselt kõrgelt konserveerunud karboksüterminaalsest topelt-glütsiinipaarist, et ehitada keerukaid ubikvitiini ahelaid, mis annavad märku valgu lagunemisest [46] [reprodutseeritud siin kui [5]]. Glüfosaadi asendamine mõlema olulise glütsiiniga võib eeldatavasti kahjustada valesti kokku pandud valkude ringlussevõtu protsessi. See võib hõlpsalt selgitada valesti kokku pandud valkude kuhjumist, mis on ALS-i tunnus.”

Meie õnneks Antoniou jt. [1] esitasid oma tabelis 3 täpsed glüfosaadi asendustega järjestused, mis avastati, ja Uniproti veebisait pakub tööriista, kust saab BLAST-nimelise tarkvarapaketi abil leida spetsiifilisi järjestusi sisaldavaid valke. Uniprot suutis leida kõigi nende 15 valgu identiteedi, mis on toodud joonisel 3 tabamustena, vastates täpselt iga valgu järjestusele. Kõik 15 valku olid inimvalgud. Vähemalt üheksa neist valkudest seonduvad fosfaati sisaldavate molekulidega, nagu on loetletud tabelis 1. See toetab ideed, et fosfaati siduvad valgud on eriti vastuvõtlikud glüfosaadi asendamisele, nagu öeldi hiljutises Gunatilake et al. [6], tehes ettepaneku, et glüfosaat on Sri Lanka põllumajandustöötajate seas teadmata etioloogiaga kroonilise neeruhaiguse (CKDu) peamine tegur. Tegelikult sisaldab taimedes sisalduv valk EPSP süntaas, mis arvatakse olevat umbrohtude hävitamisel glüfosaadi peamine sihtmärk, fosfoenoolpüruvaadi (PEP) seondumiskohas kõrgelt konserveeritud glütsiinijääki. DowDuponti teadlased on suutnud CRISPR-tehnoloogia abil luua glüfosaadile resistentse maisitüve CRISPR-modifitseeritud geeni tõttu EPSP süntaasi jaoks [7]. Esimene samm, mille nad tegid, oli DNA-koodi muutmine, et PEP-i seondumiskohas asuv glütsiin asendataks alaniiniga. Selle tulemuseks oli ensüümi versioon, mis oli glüfosaadi suhtes täiesti tundetu.

Tabel 1: üheksa valku, mis sisaldavad glüfosaadiga asendatud peptiide, mis on identifitseeritud Tandem Mass Tag (TMT) spektromeetriatööriistade abil. Neid peptiide koos veel 6-ga leiti kultuuris kasvatatud vähirakkudes. Kõik üheksa seonduvad fosfaati sisaldavate molekulidega, nagu on näidatud kolmandas veerus. Esimeses veerus esitatakse tuvastatud järjestus, kus “*” tähistab glütsiinijääki, mis leiti olevat asendatud. Vt: Antoniou jt. (2019) üksikasjad eksperimentaalse seadistuse kohta.

Kokku näitab tabel 1 intrigeerivat loetelu inimvalkudest ja arvatavasti ekspresseeriksid paljud neist rinnavähirakkudes. Näiteks on üks RNA metüülimisvalk (tRNA (guaniin(10)-N2) -metüültransferaasi homoloog). Teisel on kasvaja supressori funktsioon läbi Akt-i inhibeerimise, seondudes fosfatidüülinositoolfosfaatidega (Pleckstrini homoloogilist domeeni sisaldav perekonna A liige 5). Teine on G-valguga seotud retseptor (GPCR). Bar-Shaviti jt sõnul on “GPCR-id kontrollivad kasvaja tekke paljusid tunnuseid, sealhulgas immuunrakkude vahendatud funktsioone, proliferatsiooni, invasiooni ja ellujäämist sekundaarses kohas.” [8] Teine hitt on homokastivalk ja arvatakse, et sellel valkude klassil on konkreetselt põhjuslik roll rinnavähi korral [9].

Veel üks oluline avastus selles dokumendis on kaks valku, mis tuvastati statistiliselt oluliselt üle reguleerituna vastusena kuuepäevasele glüfosaadiga töötlemisele. Need on: ADP/ATP nukleotiid translokaas (ANT) ja seriini-/arginiinirikas splaissingufaktor 6 (SRSF6) [1]. Need kaks valku osutuvad väga huvitavaks, kuna mõlemad on kasvajarakkudes üleekspresseeritud ja mõlemal juhul on nende valkude kõrgem tase seotud vähihaigete halva tulemusega.

SRSF6 on splaissingufaktorite perekonna liige, kellel on võimas võime muuta valgu ekspressiooni, muutes peptiidide kokkupanemist üksikutest eksonitest. SRSF6 üleekspresseerimine kopsuepiteelirakkudes suurendas proliferatsiooni, kaitses neid kemoteraapia eest ja suurendas nende võimet kasvajaid moodustada [10]. Lisaks vähendas SRSF6 koputamine kopsu- ja käärsoolevähi rakuliinides nende tuumorigeenilist potentsiaali. SRSF6 väljendub sageli nahavähis ja see muudab tenassiin C-nimelise valgu splaissingu invasiivse ja metastaatilise vähi soodustamiseks [11]. SRSF6 põhjustab ka psoriaasile iseloomuliku tunnuse keratinotsüütide liigset paljunemist [12]. Kui glüfosaat põhjustab SRSF6 ülereguleerimist rinnavähirakkudes, põhjustab see tõenäoliselt kokku puutunud inimeste kasvaja teket.

ANT on mitmes erinevas isovormis, millel on rakubioloogiale erinev toime, kuid see, mida rinnavähirakkudes on palju ekspresseeritud, on ANT2 ja see on osutunud oluliseks kasvaja ellujäämise säilitamisel. ANT2 ülesanne on transportida ATP mitokondritesse ja see tegevus on oluline, kui rakk töötab Warburgi efekti eelduste kohaselt. Vähirakud toodavad glükolüüsi teel tsütoplasmas palju oma ATP-d ja seejärel viib ANT2 ATP mitokondritesse, et nad saaksid oksüdatiivse fosforüülimise kaudu vähendada vajaliku ATP hulka. See on hea strateegia oksüdatiivsete kahjustuste eest kaitsmiseks, eriti kui mitokondrid võivad toksilise kokkupuute põhjustatud DNA mutatsioonide tõttu düsfunktsioneerida. ANT2 programmeerib raku tegelikult strateegiate rakendamiseks, mis põhjustavad stressorite juuresolekul apoptoosi (rakusurma) asemel pigem proliferatsiooni [13]. Hiljuti on olnud huvi selliste ravimite väljatöötamise vastu, mis võitlevad vähiga ANT2 aktiivsuse pärssimise kaudu [14].

Antoniou jt. paber võib olla märkimisväärne läbimurre meie püüdlustes leida valkudes glüfosaadiga saastumist. On tähelepanuväärne, et nad suutsid tuvastada 15 inimvalku, mida näib olevat modifitseeritud glüfosaadi asendamise teel konkreetse glütsiinijäägiga. Paberil on laiemale kogukonnale suur väärtus, sest see täpsustab ettenähtud protseduuri, mida saab nüüd üsna rutiinselt rakendada mitmel teisel kultuuris kasvatatud rakutüübil, samuti imetajate haigestunud kudedest, näiteks küüntel, ekstraheeritud bioloogilistel proovidel. sklerodermiaga patsientide naharakud psoriaasihaigetel, autistlike laste juukseproovid, asutaja, hobuse kabjad, kasvajabiopsiad, Alzheimeri tõvega surnukeha, haiged neeru-ja maksakuded jne.

Tulevased võimalused glüfosaadiga saastunud valkude avastamiseks on rikkalikud ja kui kogume spetsiifiliste asendusmustrite andmebaasi, võime isegi prognoosida reegleid peptiidikontekstide jaoks, kus glütsiini jäägid on eriti vastuvõtlikud, näiteks kui naabruses asuvad aminohapped on väikesed (et vältida steeriline takistus) või positiivselt laetud (glüfosaadi peptiidi kokkupanekukohale meelitamiseks selle negatiivse laengu tõttu). Tõepoolest, seda tüüpi reeglid ilmnevad juba Antoniou et al. katse. Kuuele 15 väidetavalt asendatud glütsiinist järgnes kohe positiivselt laetud aminohape (lüsiin, histidiin või arginiin). Ja kümnele eelnes kohe valiin, leutsiin, seriin või treoniin, mis kõik on väikesed aminohapped, toetades ruumi glüfosaadi metüülfosfonüülsaba jaoks. Kui glüfosaat asendab valkude sünteesi ajal glütsiini tõepoolest, on selle tagajärjed hämmastavad ja glüfosaadi salakaval kumulatiivne toksiline toime võib kergesti seletada tõusu, mida näeme täna autoimmuunsete, metaboolsete, neuroloogiliste ja onkoloogiliste haiguste pika nimekirja levimuses.

Viited

[1] MN Antoniou et al. Glyphosate does not substitute for glycine in proteins of actively dividing mammalian cells. BMC Res Notes 2019; 12:494. (Veebilink)
[2] A Samsel and S Seneff. Glyphosate, pathways to modern diseases V: Amino acid analogue of glycine in diverse proteins. Journal of Biological Physics and Chemistry 2016; 16: 9-46. (Veebilink) (Download)
[3] A Zulet et al. Proteolytic Pathways Induced by Herbicides That Inhibit Amino Acid Biosynthesis. PLoS ONE 2013; 8(9): e73847. (Veebilink)
[4] S Seneff et al. Does glyphosate acting as a glycine analogue contribute to ALS? J Bioinfo Proteomics Rev 2016: 2(3): 1-21. (Veebilink) (Download)
[5] A Zuin et al. Ubiquitin signaling: Extreme conservation as a source of diversity. Cells 2014; 3(3): 690-701. (Veebilink)
[6] S Gunatilake et al. Glyphosate’s Synergistic Toxicity in Combination with Other Factors as a Cause of Chronic Kidney Disease of Unknown Origin. Int J Environ Res Public Health 2019; 16(15). pii: E2734. (Veebilink) (Download)
[7] Y Dong et al. Desensitizing plant EPSP synthase to glyphosate: Optimized global sequence context accommodates a glycine-to-alanine change in the active site. J Biol Chem 2019; 294(2): 716-725. (Veebilink)
[8] R Bar-Shavit et al. G Protein-Coupled Receptors in Cancer. Int J Mol Sci 2016; 17(8). pii: E1320. (Veebilink)
[9] MT Lewis. Homeobox genes in mammary gland development and neoplasia. Breast Cancer Research 2000; 2: 159. (Veebilink)
[10] M Cohen-Eliav et al. The splicing factor SRSF6 is amplified and is an oncoprotein in lung and colon cancers. J Pathol 2013; 229(4): 630-9. (Veebilink)
[11] MA Jensen et al. Splicing factor SRSF6 promotes hyperplasia of sensitized skin. Nat Struct Mol Biol 2014; 21(2): 189197. (Veebilink)
[12] H Valdimarsson et al. Psoriasis: a disease of abnormal Keratinocyte proliferation induced by T lymphocytes. Immunol Today 1986; 7(9): 256-9. (Veebilink)
[13] SH Baik and J Lee. Adenine nucleotide translocase 2: an emerging player in cancer. J Stem Cell Res Med 2016; 1(2): 66-68. (Veebilink)
[14] J-Y Jang et al. Suppression of adenine nucleotide translocase-2 by vector-based siRNA in human breast cancer cells induces apoptosis and inhibits tumor growth in vitro and in vivo. Breast Cancer Research 2008; 10(1): R11. (Veebilink)